类泛素蛋白质ISG15对慢性粒细胞性白血病细胞及肝癌细胞的作用机制研究

【摘要】背景与目的：干扰素-αα是细胞分泌的可溶性细胞因子,具有抗病毒、调节免疫功能、抑制细胞生长的作用。干扰素-α具有广谱抗病毒功能,能通过抑制病毒吸附、抑制病毒RNA及DNA合成、增加机体免疫功能等多种机制抑制病毒的增殖；干扰素-α能刺激淋巴细胞形成与分化,促进T细胞生长,激活肿瘤细胞表面抗原,抑制肿瘤细胞免疫逃逸,增强机体对肿瘤细胞的自身清除能力。临床应用干扰素-α能够抑制恶性肿瘤细胞的增殖与转移,并能通过促进免疫反应增加肿瘤细胞的凋亡。慢性粒细胞性白血病严重威胁人们的生存与健康,其发生源自位于9号染色体的abl基因与位于22号染色体的bcr基因异位并融合形成bcr-abl嵌合基因,bcr-abl嵌合基因可编码具有强酪氨酸激酶活性的p210BCR-ABL融合蛋白质,P210BCR-ABL可持续激活细胞分裂,抑制细胞凋亡,最终导致细胞恶性增殖并形成肿瘤。干扰素-αα是治疗慢性粒细胞性白血病的里程碑药物,干扰素-αα能通过刺激Janus激酶-信号转导子与转录激活子等途径有效缓解慢性粒细胞性白血病病程,减少慢性粒细胞性白血病细胞中P210BCR-ABL融合蛋白质的表达从而改善患者的症状,并能显著提高患者的生活质量,是目前治疗慢性粒细胞性白血病的常用药物。肝癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一,干扰素-α能有效抑制肝癌的生长,具有较好疗效。ISG15是干扰素刺激基因15的表达产物,经干扰素诱导而高水平表达,因其结构与泛素类似,故又称泛素交叉反应蛋白质。ISG15在其级联酶系的参与下能将自身羧基端LRLRGG残基与目标蛋白质赖氨酸残基的ε-氨基共价结合。ISG15能够修饰RNA转录、剪接、翻译过程中的多种蛋白质,因此具有多种生物学功能。目前已经证明ISG15在抗病毒、抗肿瘤方面具有重要作用。ISG15能阻断多种DNA及RNA病毒的复制与释放,具有广谱抗病毒功能,是介导干扰素-αα抗病毒效应的关键功能蛋白质；ISG15及其级联酶系通过修饰多条信号通路的相关蛋白质,在许多肿瘤细胞中发现ISG15及其级联酶系表达异常。ISG15抗肿瘤的机制十分复杂,至今仍未完全阐明,研究ISG15在肿瘤细胞中的功能及其作用机制能为肿瘤治疗提供新的思路和靶向治疗位点。方法：构建穿梭载体PCDNA3.1(+)-ISG15,并转染入慢性粒细胞性白血病KT1细胞(含对干扰素-αα敏感的KT1/A3细胞及对干扰素-αα耐受的KT1/A3R细胞)和肝癌HepG2细胞。在慢性粒细胞性白血病KT1细胞中,通过细胞计数、流式细胞术等手段研究加入干扰素-α、转染PCDNA3.1(+)对照、转染PCDNA3.1(+)-ISG15、沉默ISG15及其激活酶UBE1L/解聚酶USP18的KT1细胞与对照KT1细胞在细胞增殖、凋亡等方面的变化,分析ISG15在慢性粒细胞性白血病KT1细胞中的功能；并通过检测不同处理条件下各组细胞P53、P21及Caspase3酶活性与ISG15的关系来研究ISG15行使该功能的分子机制。在肝癌HepG2细胞中,通过流式细胞术分析HepG2细胞在加入干扰素-αα、转染PCDNA3.1(+)对照及转染PCDNA3.1(+)-ISG15后HepG2细胞的凋亡率及周期变化来研究ISG15对HepG2细胞的作用；利用激光共聚焦显微镜对ISG15在各处理组HepG2细胞中进行亚细胞定位；检测不同条件下肝癌HepG2细胞中P53.P21、UBE1LUSP18、蛋白质ISG15修饰及蛋白质泛素化修饰水平来研究ISG15的具体分子机制。结果：(1)干扰素-α处理KT1/A3细胞后能抑制KT1/A3细胞增殖,促进KT1/A3细胞凋亡,但对KT1/A3R细胞增殖的抑制作用不明显；(2)过表达ISG15能够促进KT1/A3细胞及KT1/A3R细胞的凋亡；(3)干扰素-αα处理及过表达ISG15能增加KT1/A3细胞中P53、P21及ISG15的表达,但干扰素-αα处理不能提高KT1/A3R细胞中P53的表达,过表达ISG15后KT1/A3R细胞中P53和P21表达水平明显增加；(4)沉默ISG15或其激活酶UBE1L后干扰素-α抑制KT1/A3细胞增殖的能力被逆转；(5)在ISG15表达的情况下,沉默ISG15解聚酶USP18能够抑制KT1细胞增殖；(6)沉默ISG15或UBE1L后,KT1细胞中P53及P21的表达受抑制,在ISG15表达时沉默USP18后,KT1细胞中P53与P21的表达增加；(7)干扰素-α处理不能抑制HepG2细胞增殖,过表达ISG15能够抑制HepG2细胞增殖；(8)ISG15分布在HepG2细胞的细胞核和细胞浆中；(9)干扰素-α处理HepG2细胞后UBE1L与USP18表达增加,但并未见P53、P21表达水平提高,蛋白质泛素化修饰水平也未增加；(10)过表达ISG15后HepG2细胞内P53、P21表达上调,蛋白质泛素化修饰水平及蛋白质的ISG15修饰水平提高,但UBE1L与USP18表达变化不明显。结论：(1)慢性粒细胞性白血病KT1/A3细胞对干扰素α敏感、KT1/A3R细胞对干扰素α不敏感；(2)ISG15通过上调P53及P21的表达抑制慢性粒细胞性白血病细胞增殖,且ISG15促慢性粒细胞性白血病凋亡的能力依赖于P53表达；(3)干扰素α不能诱导肝癌HepG2细胞中P53与P21的表达,也不能抑制HepG2细胞增殖；(4)过表达ISG15能够增加HepG2细胞中P53与P21的含量,并能抑制HepG2细胞增殖。
【作者】万新星；
【导师】陈汉春；张殿政；
【作者基本信息】中南大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】ISG15；肝癌；慢性粒细胞性白血病；P53；P21；泛素；干扰素-α；

【参考文献】
[1]马宏忠,耿志慧,陈楷,王春宁,李凯,李勇.基于振动的电力变压器绕组变形故障诊断新方法[J].电力系统自动化,2013,08:89-95.
[2]张龙宁.两种杨树人工林细根形态对水肥措施的响应[D].北京林业大学,森林培育,2013,硕士.
[3]张抚秀.城市中“人在户不在”老年人口的主要特征及其社区为老服务研究[D].华东师范大学,人口学,2013,硕士.
[4]关丛荣.条纹分隔颜色格雷码结构光三维测量技术研究[D].哈尔滨理工大学,2009.
[5]刘浩鑫.投资性房地产公允价值计量的财务影响[D].河北大学,会计,2014,硕士.
[6]曹畅.我国大众体育民生化发展之路研究[D].湖南科技大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[7]邵宏强.城市居民休闲行为与休闲产业空间研究[D].西安外国语大学,人文地理学,2013,硕士.
[8]樊后保.森林降水酸度及电导率的时空变化[J].植物生态学报,2000,04:463-467.
[9]李卓.20世纪90年代以来新散文研究[D].湖南师范大学,写作学,2013,硕士.
[10]刘微微.日本学生习得汉语祈使句的情况考察及偏误分析[D].吉林大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[11]王宏梅.高产乙醛嗜热链球菌的筛选及其关键基因表达研究[D].内蒙古农业大学,食品科学,2013,硕士.
[12]李子宝.一类耗散型Camassa-Holm方程的解的研究[D].云南师范大学,基础数学,2013,硕士.
[13]孟凡华.新形势下乡镇政府职能转变研究[D].中国海洋大学,公共管理,2011,硕士.
[14]邢蕊,李根.全球化对城市文化和建筑的影响[J].河北建筑工程学院学报,2014,04:45-47.
[15]封静.大学生语言自主学习中心英语学习策略与学习焦虑的相关性研究[D].湖北工业大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[16]张燕.证券交易所规则研究[D].对外经济贸易大学,法律,2004,硕士.
[17]李涛.基于WSN的智能气象传感器设计及应用[D].苏州大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[18]刘康.AlN纳米结构的制备与表征[D].哈尔滨工业大学,工程力学,2014,硕士.
[19]向洁.基于虚拟机调度的云数据中心节能算法研究[D].中国矿业大学,通信与信息系统,2014,硕士.
[20]刘志鹏,赵伟,陈小宏,朱振宇,郝振江.局部频率域SVD压制随机噪声方法[J].石油地球物理勘探,2012,02:202-206+179.
[21]徐乐怡,李楠,范彬斌,陈新锐.浙江海洋经济发展的SWOT分析及对策研究[J].现代物业(中旬刊),2014,05:4-6.
[22]高志会.人力资源管理外包模型研究[D].河北大学,企业管理,2014,硕士.
[23]李伟伟.事业单位改革背景下科技中介机构的发展研究[D].山东大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[24]陈曾,侯进,张登胜,张华忠.基于语义区域提取的图像重排[J].自动化学报,2011,11:1356-1359.
[25]陈天柱.“婚嫁喜玫瑰”品牌营销战略研究[D].湘潭大学,工商管理,2012,硕士.
[26]金昌明.调神安神针刺法治疗原发性失眠症的临床研究[D].黑龙江中医药大学,针灸推拿学（专业学位）,2013,硕士.
[27]李雅楠.联络口译中的礼仪问题—以笔者在第四届欧亚经济论坛上的联络口译实践为例[D].西安外国语大学,翻译,2013,硕士.
[28]王旭光.东营水城雪莲大剧院项目预算评审风险研究[D].山东大学,工业工程（专业学位）,2012,硕士.
[29]殷霞.体育院校表演专业本科生实践能力及培养途径研究[D].南京体育学院,运动训练（专业学位）,2013,硕士.
[30]顾洪良.商业地产的区位选择研究[D].宁波大学,区域经济学,2014,硕士.
[31]沈娥,刘紫嫣,周豪,李端行,张旭旺,王经伟,沈文丽,曲媛媛,周集体.CupriavidusmetalliduransSHE好氧还原Se(IV)合成硒纳米颗粒的特性研究[J].环境科学学报.
[32]程红福.网络图书资源结构化管理研究[D].江苏科技大学,计算机软件与理论,2014,硕士.
[33]赵程.基于视觉—语音交互式室内层次地图构建与导航系统[D].厦门大学,计算机技术,2014,硕士.
[34]陈忠萍.X公司核心员工的忠诚度问题分析[D].华东理工大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[35]范亚君.400V/200kA合成试验系统研究设计[D].沈阳工业大学,电气工程,2013,硕士.
[36]刘业博,刘志明,姚拴宝.列车绕流的瞬态与稳态数值模拟对比[J].北京交通大学学报,2014,04:32-39.
[37]李阳,刘艳,刘志波,简水生.基于增强瑞利反馈的单模窄线宽随机激光器[J].物理学报.
[38]赵怿甦.数据挖掘在农业环境中的应用[D].天津大学,2004.
[39]李二敏.探析中美贸易差额—原因及理性对策[D].安徽大学,国际贸易学,2004,硕士.
[40]戴强.避雨栽培条件下富士和金冠生长结果特性的研究[D].南京农业大学,果树学,2012,硕士.
[41]张俊芳.高校校园网升级改造方案的设计与实现[D].华南理工大学,计算机技术,2014,硕士.
[42]吴涛,李锋.基于TPI的特色数据库建设实践[J].现代情报,2005,07:165-168.
[43]毛文莉.影响危机决策的主要因素分析[D].中国人民解放军外国语学院,国际政治,2004,硕士.
[44]郭玲.戏剧《卖花女》对话中的会话含义分析[D].内蒙古师范大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[45]薛佩军,管延勇.正负域覆盖广义粗集及其运算公理化[J].计算机工程与应用,2005,27:35-37+55.
[46]段汝欣.目的论在蓝诗玲英译《阿Q正传》中的体现[D].沈阳师范大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[47]董维娅.《青草在歌唱》的空间解读[D].湖北大学,英语语言文学,2012,硕士.
[48]陆亚.桑巴特社会主义思想研究[D].南京大学,马克思主义哲学,2013,硕士.
[49]赵杨.《经济与法》栏目定位与创作理念分析[D].兰州大学,新闻与传播（专业学位）,2013,硕士.
[50]刘斌.信用缺失下的企业信用风险管理研究[D].西南交通大学,2003.